Методика забарвлення по Граму – експрес-метод, що дозволяє визначити вид бактерій. Технологія виявлення патогенів розроблена бактеріологом Гансом Грамом. Він був незвичайною людиною, скромним. У своїй роботі він сказав: «Я публікую методику забарвлення, свідомо знаючи, що вона має деякі недоліки, але я не втрачаю надії, що мій метод буде доопрацьований і стане корисним». Так і сталося. Його технологія стала однією з провідних при визначенні типу бактерій. Методика забарвлення за Грамом заснована на будову прокаріотів, з-за чого бактерії набувають той чи інший відтінок.
Рекомендації
Перш ніж приступити до фарбування, необхідно підготувати робоче місце і зразок. Від якості останнього залежить, наскільки хорошим буде результат. Наприклад, для аналізу беруть мокротиння глибокого кашлю, а не просто слину.
При роботі зі зразками обов’язково дотримуються правила безпеки. Під час роботи на руках повинні бути рукавички. Також варто бути уважним при роботі зі спиртом, ацетоном. Ці речовини вогненебезпечні і легко спалахують при нагріванні.
При роботі з предметними скельцями їх акуратно беруть пінцетом або двома пальцями за бічні краї так, щоб не чіпати мазок.
Підготовка до роботи
Починається методика забарвлення за Грамом з підготовки себе до майбутньої роботі. На руки обов’язково надягають стерильні рукавички, довгі волосся повинні бути прибрані, підв’язані. Робоче місце повинно розташовуватися в стерильному, добре провітрюваному приміщенні. Перед проведенням маніпуляції обов’язково перевіряється працездатність мікроскопа.
Наступним кроком буде підготовка предметних стекол. Якщо вони недостатньо чисті, то скла промивають під проточною водою з милом. Це допоможе видалити бруд, жир. Обов’язково поверхня обробляється спиртом або іншим способом, що використовуються в лабораторії.
Підготовка зразка
Методика забарвлення за Грамом передбачає підготовку зразка. Для цього беруть предметне скло і на його центр акуратно поміщають зразок. Методика фарбування мазків за Грамом дає можливість побачити тип бактерій, культивованих в чашці Петрі.
Для початку роботи на скло наносять тонкий шар досліджуваної рідини. Не варто чекати більше доби від початку забору матеріалу до проведення аналізу, так як у багатьох патогенів руйнується клітинна стінка, і реакція на фарбування стає абсолютно непередбачуваною. Якщо ж передбачається почати дослідження тканин, то на предметне скло слід нанести кілька крапель матеріалу. Рідина розподіляється по склу рівним шаром ребром іншого скла. Зразком дають підсохнути.
Якщо для фарбування беруть зразок з чашки Петрі, то процедуру забору матеріалу проводять петлею. А при дослідженні мазка його притискають до предметного скла іншим склом.
Фіксація зразка
Методика забарвлення препарату за Грамом передбачає фіксацію зразка. Під дією тепла бактерії пристають до скла і не змиваються.
Для того щоб закріпити мазок, необхідно провести над пальником предметне скло. Не можна перегрівати скло, щоб у зразку не з’явилося змін.
Можна зафіксувати зразок метанолом. Для цього скло необхідно нанести кілька крапель метилового спирту, а надлишки злити. Скло просушується природним способом. Цей метод переважно з-за того, що він менше пошкоджує досліджувані клітини і показує більш чистий фон.
Фарбування
Методика приготування мазка препаратів забарвлення за Грамом передбачає фарбування в ємності, в яку буде поміщений зразок. Зазвичай для цього використовується лоток або скляне блюдце. В нього поміщають предметне скло з препаратом так, щоб рідина стікала в лоток.
Спочатку на зразок наноситься розчин кристалічного фіолетового або генцианово-фіолетового. Його набирають у піпетку і кілька крапель наносять на препарат. Через хвилину проводять оцінку результату. Всі грампозитивні патогени забарвляться в фіолетовий колір.
Потім барвник змивають водою так, щоб вона злегка обмила мазок. Далі на зразок наноситься йод і залишається на хвилину. Після цього так само акуратно змивають. Після цієї процедури на скло наноситься обесцвечивающее речовина. Це може бути розчин ацетону і спирту. Розчином обробляють мазок до тих пір, поки не зникне фіолетовий відтінок.
На мазок наноситься контрастний барвник. Це може бути фуксин або сафран. Він дозволяє створити контраст між грамнегативними та грампозитивними бактеріями. У результаті впливу препарату грамнегативні патогени забарвлюються в фуксиевый колір. Барвник змивають водою.
Завершальним етапом є просушування предметного скла. Після цього методика забарвлення за Грамом (в мікробіології вона використовується досить часто) вважається завершеною.
Оцінка результатів
Предметне скло поміщають під мікроскоп. Грампозитивні бактерії в мазку будуть пофарбовані у фіолетовий колір. Грамнегативні бактерії забарвляться в рожевий або червоний відтінок. Таке розмаїття виникає в результаті особливості будови стінок патогенів. В одні проникає тільки барвник фіолетовий, а в інші – фуксиевый.
До помилкового результату може призвести тривале знаходження предметного скла під дією знебарвлювати рідини. Тому процедуру проводять двічі, щоб переконатися в правильності діагнозу. Повторний аналіз дозволяє упевнитися, що забарвлення проведена правильно.
Під час роботи з патогенними мікроорганізмами завжди дотримуйтеся обережності, так як від цього залежить ваше здоров’я.
