Протеоміка – функціональна наука, основним предметом вивчення якої є протеом. Протеом являє собою весь набір білків, які продукуються або модифікуються організмом або системою. Протеоміка – наука, що вивчає види білка, а тому вона допомогла відкрити безліч нових видів цього з’єднання – набагато більше, ніж було відомо до її виникнення як науки. Кількість білків, як виявилося, залежить від часу і різних вимог чи стреси, яким піддаються клітини або організми. Протеоміка – це міждисциплінарна область, яка в значній мірі зумовлена новітніми проектами з вивчення геному. Вона охоплює дослідження протеомов загального рівня білкового складу, структури та активності. Функціональна протеоміка часто називається найважливішим компонентом функціональної геноміки.
Предмет дослідження
Дати визначення протеоміка не так просто, як може здатися на перший погляд. Ця наука зазвичай передбачає великомасштабний експериментальний аналіз білків і протеомов, але часто використовується для вивчення можливостей очищення білків.
Після геноміки та транскриптомики протеоміка є наступним кроком у вивченні біологічних систем. Вона набагато складніше, ніж геноміка, тому що геном організму більш або менш постійний, тоді як протеом відрізняється від клітини до клітини і час від часу. Окремі гени експресуються в різних типах клітин, а це означає, що навіть основний набір білків, які продукуються в клітці, необхідно ідентифікувати.
Історія вивчення
Протеоміка вивчення структури білків – напрям у біохімії, выделившееся відносно недавно. У минулому дослідження білків проводили за допомогою аналізу РНК, але виявилося, що структура РНК ніяк не корелює з вмістом білка. Відомо, що мРНК не завжди транслюється в білок, а кількість білка, продукованого для даної кількості мРНК, залежить від того, який ген транскрибується, а також від фізіологічного стану клітини. Протеоміка – наука, яка підтверджує наявність білка і забезпечує пряму оцінку присутнього кількості.
Наступні зміни
Мало того, що витяг білка з мРНК викликає його пошкодження, але, крім того, багато білки також піддаються широкого спектру хімічних модифікацій після цього процесу. Багато з цих посттрансляційних модифікацій мають вирішальне значення для функції білка.
Фосфорилювання
Однією з таких модифікацій є фосфорилювання, яке відбувається з багатьма ферментами і структурними білками в процесі клітинної передачі сигналів. Додавання фосфату до певних амінокислот, найчастіше серинам і треонину, опосредуемым серин / треонинаминазами або рідше тирозином, опосередкованим тирозинкиназами, змушує молекулу білка стати мішенню для зв’язування або взаємодії з різним набором інших молекул, які розпізнають фосфорильований домен.
Оскільки фосфорилювання білка є однією з найбільш вивчених його модифікацій, багато «протеомические» зусилля спрямовані на визначення набору фосфорильованих білків в конкретній клітці або тканинному типі при певних обставинах.
Убиквитинирование
Убіквітин являє собою невеликий білок, який може бути прикріплений до певних субстратів ферментами, по-науковому званими E3 ubiquitin-ligases. Визначення того, які білки є полі-убиквитинированными, допомагає зрозуміти, як регулюється рух молекул цієї речовини. Аналогічним чином, як тільки дослідник визначає, які субстрати убиквитированы кожної лигазой, корисно визначити набір лигаз, виражених в конкретному типі клітин.
Додаткові зміни
Крім фосфорилювання і убиквитинирования, білки можуть бути піддані (зокрема) метилированию, ацетилювання, гликозилированию, окислення і нитрозилированию. Деякі білки піддаються всім цим змінам, часто залежать від часу комбінаціях. Це ілюструє потенційну складність вивчення структури і функції білка.
Окремі білки, що виробляються в різних умовах. Клітина може створювати різні набори білків у різний час або в різних умовах, наприклад, під час розвитку, клітинної диференціації, клітинного циклу або канцерогенезу. Подальше збільшення складності протеому, як вже згадувалося, передбачає, що більшість білків можуть піддаватися широкого спектру посттрансляційних модифікацій.
Тому дослідження в області протеоміки – це в перспективі складне завдання, навіть якщо тема вивчення цієї науки, як і раніше, буде обмеженою. При більш амбітні завдання, наприклад, коли шукають біомаркери для конкретного підтипу раку, вчений-протеомист може вибрати вивчення декількох зразків сироватки крові у декількох пацієнтів з раком, щоб звести до мінімуму змішуючі фактори. Таким чином, складні експериментальні конструкції іноді необхідні для обліку динамічної складності протеому.
Відмінності від геноміки
Протеоміка дає різні рівні розуміння, ніж геноміка з багатьох причин:
- Рівень транскрипції гена дає лише приблизну оцінку його рівня трансляції в білок. Отриману в достатку мРНК можна швидко деградувати або трансформувати не найефективнішим чином, у результаті чого утворюється невелика кількість білка.
- Як згадано вище, багато білки зазнають посттрансляционные модифікації, які сильно впливають на їх функціональність. Наприклад, деякі білки не активні до тих пір, поки не стануть фосфорилированными. Методи, такі як фосфопротеомика і гликопротеомика, використовуються для вивчення посттрансляційних модифікацій.
- Багато транскрипти призводять до появи більш одного білка, шляхом альтернативного зрощування або альтернативних посттрансляційних модифікацій.
- Багато білки утворюють комплекси з іншими білками або молекулами РНК і діють тільки у присутності інших молекул. Ступінь деградації білка відіграє важливу роль в його змісті.
Відтворюваність
Одним з основних факторів, що впливають на відтворюваність експериментів в протеомике, є одночасне элюирование багатьох інших пептидів, які можуть бути виміряні мас-спектрометрами. Це призводить до стохастичним відмінностей між експериментами з-за залежного від даних прийомів триптических пептидів. Хоча ранні великомасштабні аналізи протеому дріжджів показали значну мінливість в результатах між різними лабораторіями, мабуть, частково із-за технічних і експериментальних відмінностей між ними, відтворюваність була поліпшена в більш пізньому мас-спектрометрическом аналізі, особливо при використанні мас-спектрометрів.
Методи дослідження
У протеомике існує безліч методів вивчення білків. Як правило, вони можуть бути виявлені з використанням антитіл (імунологічних аналізів) або за допомогою мас-спектрометрії. Якщо аналізується складний біологічний зразок, необхідно або використовувати дуже специфічне антитіло в кількісному метоп-блот-аналізу (qdb), або біохімічне поділ.
Виявлення білка з допомогою антитіл (імунологічних аналізів)
Антитіла до окремих білків або їх модифікованих форм використовувалися в дослідженнях біохімії та клітинної біології. Вони відносяться до числа найбільш розповсюджених інструментів, використовуваних сьогодні молекулярними біологами. Існує кілька конкретних методів і протоколів, які предплагают використання антитіл для виявлення білка. Протягом десятиліть фермент-пов’язаний иммуносорбентный аналіз (ELISA) використовувався для їх виявлення і кількісного виміру у зразках біологічного речовини. Вестерн-блот може бути використаний для виявлення і кількісного визначення окремих білків, де на початковому етапі складну органічну суміш розділяють з використанням SDS-PAGE, а потім зацікавив білок ідентифікують з використанням антитіла.
Модифіковані білки можуть бути вивчені шляхом розробки антитіла, специфічного для цієї модифікації. Наприклад, існують антитіла, які розпізнають тільки певні білки, коли вони є тирозинфосфорилированными, відомими як фосфоспецифические антитіла. Крім того, існують антитіла, специфічні для інших модифікацій. Вони можуть бути використані для визначення набору білків, що піддалися модифікації.
Протеоміка в медицині
Виявлення захворювань на молекулярному рівні є рушійною силою нової революції в області діагностики і лікування. Технологія цифрового иммуноанализа поліпшила чутливість виявлення молекул до так званого аттомолярного діапазону. Ця можливість дає нам потенціал для відкриття нових досягнень у галузі діагностики та терапії, але такі технології були віднесені до ручних процедур, які не дуже добре підходять для ефективного щоденного використання.
Хоча виявлення білка з антитілами все ще дуже поширена в молекулярній біології, були розроблені й інші методи, які не покладаються на антитіло. Ці методи пропонують різні переваги, наприклад, вони часто можуть визначати послідовність білка або пептиду, вони можуть мати більш високу пропускну здатність, ніж антитіло, і іноді вони можуть ідентифікувати і кількісно визначати білки, для яких не існує антитіл.
Методи протеоміки
Одним з найбільш ранніх методів аналізу білка була деградація Эдмана (введена в 1967 році), де один пептид піддається кількох стадій хімічного розкладання, щоб визначити її послідовність. Ці методи в основному були витіснені технологіями, які забезпечують більш високу пропускну здатність. Від методів залежать і різні напрямки протеоміки.
Основні методи розділення
Для аналізу складних біологічних зразків потрібно зниження їх складності. Це можна виконати за допомогою одновимірного чи двовимірного розподілу. Зовсім недавно були розроблені онлайн методи, в яких індивідуальні пептиди були розділені з використанням хроматографії з оберненою фазою, а потім безпосередньо іонізовані з використанням методу ESI.
Гібридні технології
Існує кілька гібридних технологій, які використовують очищення окремих аналітів на основі антитіл, а потім проводять мас-спектрометричний аналіз для їх ідентифікації і кількісної оцінки. Прикладами цих методів є метод MSIA (мас-спектрометричний иммуноанализ), розроблений Рэндалом Нельсоном в 1995 році, і метод SISCAPA (стабільний ізотопний стандартний захоплення з антипептидными антитілами), введений Чи Андерсоном в 2004 році.
Порівняльний протеомический аналіз може виявити роль білків у складних біологічних системах, включаючи розмноження. Наприклад, лікування інсектицидом триазофосом призводить до збільшення вмісту коричневих саджанців (Nolaparvata lugens (Stål)) – чоловічих допоміжних залізних білків (Acps), які можуть бути передані самкам допомогою спарювання, що призводить до збільшення народжуваності (тобто плодючості) жінок. Щоб виявити зміни в типах білків допоміжних залоз (Acps) і репродуктивних білків, отриманих від самців коників, дослідники провели порівняльний протеомический аналіз сплячих самців виду N. lugens. Результати показали, що ці білки беруть участь у репродуктивному процесі дорослих самок і самців коників N. lugens.
Високопродуктивні технології протеомические
Протеоміка – наука, яка неухильно набирала обертів протягом останнього десятиліття. Багато з підходів, розроблених цією наукою, абсолютно революційні, деякі ж ґрунтуються на старих наукових методах. Методи на основі мас-спектрометрії та микроячейки є найбільш поширеними технологіями для великомасштабного вивчення білків.
Мас-спектрометрія і профілювання
В даний час для профілювання білка використовуються два методу мас-спектрометрії. Більш відомий і широко поширений метод використовує двомірний електрофорез з високою роздільною здатністю для поділу білків з різних зразків паралельно з подальшим відбором і фарбуванням диференційованих експресованих білків, які повинні бути ідентифіковані за допомогою мас-спектрометрії. Незважаючи на досягнення в 2DE і загальної опрацьованості цього методу, він також має свої межі. Основною проблемою є нездатність ідентифікувати всі білки в зразку, враховуючи їх варіативність та інші унікальні властивості.
Другий кількісний підхід використовує стабільні мітки ізотопу для диференційованих міток білків з двох різних складних сумішей. Тут білки в складній суміші спершу позначаються ізотопами, а потім розщеплюються з отриманням мічених пептидів. Потім мічені суміші об’єднують, причому пептиди поділяють багатовимірної рідинної хроматографією і аналізують за допомогою тандемною мас-спектрометрії. Изотопно-кодовані мітки (ICAT) являють собою широко використовуються ізотопні мітки. У цьому науковому методі цистеїнові залишки білків ковалентно приєднуються до реагенту ICAT, тим самим знижуючи складність сумішей, що виключають залишки, відмінні від цистеїну.
Протеоміка, геноміка, метаболомика – нові напрямки в біології, що відрізняються складністю та інноваційністю. Далеко не кожному під силу їх вивчення.
