Фарбування за Грамом широко поширене в мікробіології, так як це один з найпростіших способів диференціації бактерій в залежності від їх складу клітинної стінки. За Грамом всі бактерії можна розділити на грампозитивні (Грам(+)) і грамнегативні (Грам(-)). Метод фарбування за Грамом був розроблений у 1884 році, і з того часу не втратив популярності, хоча і неодноразово модифікувався.
Структура клітинної стінки
Фарбування за Грамом дозволяє виявити, до грампозитивних або грамнегативних відноситься та чи інша бактерія. Поділ бактерій на Грам(+) і Грам(-) здійснюється у відповідності з будовою їх клітинної стінки.
Клітинна стінка в найбільшій кількості містять пептидоглікан (муреин) – складна речовина, до складу якого входять пептапептид і глікан. Глікан складається з чергуються залишків N-ацетилглюкозаміну та N-ацетілмурамовою кислоти, з’єднаних один з одним β-1,4-глікозидними зв’язками. Пептидоглікан забезпечує підтримання форми клітини, осмотичну захист, а також антигенні функції.
Основні відмінності грампозитивних і грамнегативних бактерій
У різних бактерій товщина шару пептидоглікану не однакова. У бактерій, які відносять до грампозитивних, вона становить від 15 до 80 нм, в той час як у грамнегативних – від 2 до 8 нм. У той же час у грамнегативних бактерій під шаром пептидоглікану є особлива структура, якої немає у грампозитивних бактерій – периплазматическое простір. Це простір заповнений гидролитическими ферментами – β-лактамазой, рибонуклеазой 1, фосфатазой. Саме ці ферменти відповідальні за резистентність грамнегативних бактерій відносно багатьох антибіотиків.
Шар пептидоглікану Грам(-) бактерій пов’язаний з липополисахаридом – антигенною структурою, містить ендотоксин. У Грам(+) бактерій схожі функції виконують тейхоевые кислоти.
У грамнегативних бактерій є додаткова структура – зовнішня мембрана.
Суть методу фарбування
Перед тим як розпочати фарбування, готують мазки досліджуваних бактерій. Для цього на предметне скло капають воду і бактеріальної петлею додають туди культуру мікроорганізмів. Потім, після повного висихання води, мазок фіксують – предметне скло проносять кілька разів над полум’ям пальника. Фарбування мазків за Грамом більш ефективно, ніж фарбування живих бактерій – з мертвими клітинами краще зв’язуються молекули барвника.
Фарбування проводиться в кілька етапів:
- На фіксований мазок накладають невеликі шматочки фільтрувального паперу і наливають основний барвник – генціанвіолет або метиленовий синій.
- Через 3-5 хвилин знімають пофарбовану фільтрувальний папір і заливають мазок розчином Люголя на 1 хвилину. При цьому препарат темніє.
- Зливають розчин Люголя і обробляють мазок чистим етиловим спиртом: капають кілька крапель на препарат, через 20 секунд зливають. Процедуру повторюють 2-3 рази.
- Промивають скло з досліджуваним препаратом дистильованою водою.
- Проводять додаткове фарбування – дофарбовували препарат фуксином. Через 1-2 хвилини барвник змивають.
- Після висихання води вивчають під мікроскопом мазок. Грампозитивні бактерії будуть мати синьо-фіолетовий колір, грамнегативні – рожевий або червоний.
Причини різного характеру фарбування
Як було описано вище, при фарбуванні бактерій за Грамом грампозитивні бактерії забарвлюються у синьо-фіолетовий колір, а грамнегативні – в червоний або рожевий. Причина диференціального фарбування бактерій за цим методом полягає в тому, що після потрапляння в клітку розчинної форми генціанвіолета барвник переходить у нерозчинну йодну форму. Під час обробки бактерії етиловим спиртом під дією цього неполярного розчинника з мембрани екстрагуються ліпіди. Після цього мембрана стає пористою і більше не є суттєвою перешкодою для вимивання барвника. Однак пептидоглікан більш стійкий до дії неполярних розчинників, в тому числі і спирту. Саме він перешкоджає вимиванню барвника, тому бактерії з товстим муреиновым шаром забарвлюється в синьо-фіолетовий колір (грамположительно), і після обробки спиртом свій колір не змінюють.
Тонкий муреиновый шар грамнегативних бактерій не може втримати в клітці молекули барвника, тому після дії спирту вони стають безбарвними – забарвлюються грамотрицательно.
Після впливу на мазок фуксином при фарбуванні за Грамом грампозитивні бактерії залишаються синьо-фіолетовими, а грамнегативні набувають рожево-червоний відтінок.
Приклади Грам(+) і Грам(-) бактерій
До грамнегативних відносяться ціанобактерії, сіробактерії, залізобактерії, хламідії, рикетсії, оцтові бактерії, багато метилобактерии, тионовые бактерії, арсенитобактерии, карбоксидобактерии.
Грампозитивними є біфідобактерії, багато водні бактерії, стрептококи і стафілококи.
