Метод культури тканин є одним з головних інструментів сучасних біотехнологій, дозволяючи вирішувати практичні проблеми фізіології, біохімії та генетики рослин. Штучне вирощування матеріалу проводиться з дотриманням певних умов: стерилізації, температурного режиму і з витримкою в спеціальному живильному середовищі.
Сутність
Метод культури тканин є їх тривале збереження та/або штучне вирощування в лабораторних умовах у живильному середовищі. Ця технологія дозволяє створити біологічну модель для вивчення різних процесів в клітинах, існуючих поза організму рослин, людини і тварин.
В основі розмноження культури тканин рослин лежить властивість тотіпотентності – здатності клітин розвиватися до цілого організму. У тварин це реалізується тільки в запліднених яйцеклітинах (за винятком деяких видів кишковопорожнинних).
Історія розвитку
Перші спроби культивування рослинних тканин робилися німецькими вченими на рубежі XIX-XX ст. Незважаючи на те, що вони виявилися невдалими, був сформульований ряд ідей, які підтвердились у подальшому.
У 1922 р. В. Роббінс і Ст. Котте, незалежно один від одного, змогли виростити кінчики коренів кукурудзи і томатів на штучної живильному середовищі. Детальне опрацювання техніки культури клітин і тканин почалася в 30-х роках XX в. Р. Готре і Ф. Уайт довели, що при періодичній пересадки тканинних культур у свіже живильне середовище вони можуть зростати необмежено довго.
До 1959 р. в лабораторних умовах вирощувалося вже 142 види рослин. У другій половині XX ст. почалося також використання диспергованих (роз’єднаних) клітин.
Типи досліджуваного матеріалу
Розрізняють 2 основних види культур тканин рослин:
- Одержувані без руйнування і зберігають характерні особливості, властиві живому організму.
- Отримані в результаті розщеплення (хімічного, ферментативного або механічного) з первинної тканини. Можуть формуватися з однієї або декількох клітинних культур.
За способом вирощування виділяють наступні методи:
- на «кормящем шарі», при якому речовина, що стимулює ріст тканин, виділяють діляться клітини того ж виду рослин;
- з використанням тканини-«няньки», яка знаходиться поруч з культивованими клітинами;
- застосування живильного середовища від відокремленої ділиться клітинної групи;
- вирощування окремих одиничних клітин в микрокапле, насиченою за складом.
Культивування з окремих клітин пов’язане з певними труднощами. Для того щоб штучно «змусити» їх ділитися, вони повинні отримувати сигнал від сусідніх, активно функціонуючих клітин.
Одним з основних видів тканин для фізіологічних досліджень служать калюсні, що виникають при несприятливих зовнішніх факторах (зазвичай при механічному травмуванні). Вони володіють здатністю до втрати специфічних характеристик, притаманних вихідної тканини. У результаті клітини калюсу починають активно ділитися і утворюються частини рослини.
Необхідні умови
Успішність методу культури тканин і клітин залежить від наступних факторів:
- Дотримання стерильності. Для проведення пересадок застосовуються спеціальні бокси з подачею очищеного повітря, оснащені ультрафіолетовими лампами. Асептичної обробки повинні піддаватися інструменти і матеріали, одяг і руки персоналу.
- Використання спеціально підібраних поживних середовищ, що містять джерела вуглецю і енергії (зазвичай сахароза і глюкоза), мікро – та мікроелементи, регулятори росту рослин (ауксини, цитокініни), вітаміни (тіамін, рибофлавін, аскорбінова і пантотенова кислота та інші).
- Дотримання температурного (18-30° С), світлового режиму й вологості (60-70 %). Більшість калюсних культур тканин вирощують при розсіяному світлі, так як вони не містять хлоропластів, але для деяких рослин потрібно підсвічування.
В якості поживних середовищ в даний час застосовують готові комерційні склади (Мурасіге і Скуга, Гамборга і Эвелега, Уайта, Као і Михайлюка та інші).
Переваги і недоліки
Перевагами методу культури клітин і тканин є:
- хороша відтворюваність отриманих результатів;
- регулювання міжклітинних взаємодій;
- невеликий витрата реагентів;
- генетична однорідність клітинних ліній;
- можливість механізації процесу вирощування;
- контроль над умовами змісту клітин;
- низькотемпературне зберігання живих культур.
До недоліком даної біотехнології відносять:
- необхідність дотримання суворих умов асептики;
- нестабільність властивостей клітин і можливість їх небажаного змішування;
- дорожнеча хімічних реагентів;
- неповна рівноцінність культивованих тканин і клітин у живому організмі.
Застосування
Метод культури тканин використовується для проведення досліджень:
- процесів усередині клітин (синтез ДНК, РНК і білків, обмін речовин і вплив на нього за допомогою лікарських препаратів);
- міжклітинних реакцій (проходження речовин через клітинні мембрани, робота комплексу гормон-рецептор, здатність клітин злипатися один з одним, формування гістологічних структур);
- взаємодії з навколишнім середовищем (поглинання поживних речовин, зараження інфекціями, процеси зародження і розвитку пухлин та інші);
- результатів генетичних маніпуляцій з клітинами.
Перспективними напрямками біології та фармакології, при розвитку яких використовується дана технологія, є:
- отримання ефективних гербіцидів, регуляторів росту для агрономічних культур, біологічно активних сполук для застосування у виробництві лікарських препаратів (алкалоїди, стероїди та інші);
- спрямований мутагенез, виведення нових гібридів, подолання постгамной несумісності;
- клональне розмноження, яке дозволяє отримати велику кількість генетично ідентичних рослин;
- виведення вирусоустойчивых і безвірусних рослин;
- кріоконсервація генофонду;
- реконструкція тканин, створення джерел стовбурових клітин (тканинна інженерія).
