У мікробіології забарвлення за Грамом має велике значення. Її застосовують для діагностики інфекційних захворювань, виявлення патогенності бактерій. Метод дозволяє визначити подібні за формою і розміром бактерії, які належать до різних видів і родів.
Особливості забарвлення
Забарвлення бактерій за Грамом – складний метод, в якому застосовують два види забарвлення: основний і додатковий. В процесі виконання маніпуляції застосовують знебарвлюючі речовини, до яких відносяться спирти і кислоти.
У мікробіології забарвлення за Грамом проводять трифенилметановой групою барвників. До неї відносяться генциановые, метиловий синій, кристаллвиолет. Різні види бактерій дають різні окраси, утворюючи міцні сполуки з барвниками.
Забарвлення
У мікробіології забарвлення за Грамом буває двох видів: грампозитивна і грамнегативна. У першому випадку мікроорганізми дають міцні сполуки з барвниками і йодом. Під час аналізу вони не знебарвлюються при впливі зі спиртом, з-за чого не змінюють свого первісного фіолетового відтінку.
Грамнегативні окраси утворюються при дії з йодом і легко руйнуються під дією йоду. У результаті мікроби знебарвлюються, а потім набувають червоний відтінок.
Підготовка матеріалу
За правилами мікробіології, забарвлення за Грамом вимагає попередньої підготовки матеріалів. Його необхідно розподілити тонким шаром по поверхні скла. Потім мазок підсушують і після повного висихання фіксують. При цьому мазок закріплюється на склі, що дозволяє виключити змивання бактерій барвниками. До того ж мертві мікроорганізми забарвлюються краще, ніж живі.
Після підготовки матеріалу підбирають метод фарбування: фізичний або хімічний. Перший передбачає вплив високої температури на мікробну клітину. Під час хімічного способу застосовують різні хімічні речовини, які викликають коагуляцію білків цитоплазми.
Готують набір для фарбування за Грамом, предметні скельця з бактеріями. Їх беруть пінцетом або акуратно пальцями за ребра мазком вгору, потім проводять пару раз над верхом полум’я пальника. Процес повинен займати пару секунд.
Процес фіксації хімічним методом передбачає використання ацетону, спирту, спеціальних сумішей, рідину Карнуа. Предметне скло з висушеним мазком занурюють у фіксує речовина на п’ятнадцять хвилин, потім просушують на повітрі.
Фарбування
Забарвлення мазків за Грамом проводиться за певним алгоритмом.
- Спочатку на фіксований мазок наносять основний барвник на пару хвилин. Щоб уникнути появи осаду процедуру виконують за допомогою фільтрувального паперу.
- Барвник видаляється (зливається), забирається папір. Мазок занурюється в розчин Люголя на дві хвилини або йодистий розчин по Граму до почорніння препарату.
- Мазок полощуть спиртовим розчином або ацетоном, наливаючи і зливаючи його до тих пір, поки і мазок не знебарвиться, і рідина не стане чистою. Це займає приблизно від 30 до 60 секунд.
- Скло ретельно промивають дистильованою водою.
Щоб визначити, чи є в мазку грамнегативні бактерії, проводять додатково фарбування фуксином або сафранином. Препарати наносять на дві хвилини. В кінці процедури скло промивають, висушують.
Результати
Всі грампозитивні мікроорганізми забарвлюються в темно-фіолетовий колір, а грамнегативні – в червоний. Кулясті форми зазвичай відносяться до грампозитивних видів, а покручені форми – негативно забарвлюються. Паличкоподібні бактерії можуть бути грамнегативними та грампозитивними.
Щоб отримати максимально достовірні результати досліджень, рекомендується застосовувати добові культури, а також свіжоприготовані розчини для фарбування.
Механізм забарвлення дозволяє побачити і оцінити фізико-хімічні особливості будови цитоплазми, клітинні стінки грампозитивних і грамнегативних бактерій. У перших міститься багато рибонуклеїнової кислоти, білків у цитоплазмі, а в клітинних стінках – пептидоглікану. З-за цього під час обробки мазків генцианвиолетом і Люголем у грампозитивних видів бактерій утворюється міцне з’єднання іонів йоду і барвника.
При обробці спиртами грампозитивні мікроорганізми утримують барвник, а грамнегативні – знебарвлюються і фарбуються додатково розведеним фуксином у червоний відтінок. Деякі бактерії здатні забарвлюватися тільки на стадії зростання.
Застосування
Забарвлення за Грамом проводять при аналізі виду мікроорганізмів в мазках з піхви і слини. Цей спосіб дозволяє визначити вид мікроорганізмів у кале, у плевральній, перитонеальній рідині і не тільки. Будь-які рідини, де можуть міститися бактерії, досліджують даним методом. Після проведення фарбування лікарі підбирають метод лікування, призначаючи препарати, здатні впливати на грампозитивні або грамнегативні бактерії.
