Що лежить в основі гібридизації ДНК? Хоча двухцепочечная ДНК -послідовність в цілому стабільна у фізіологічних умовах, зміна цих умов в лабораторії (як правило, шляхом підвищення температури навколишнього середовища) призведе до того, що молекули будуть розділені на окремі нитки. Останні є взаємодоповнюючими один до одного, але можуть також доповнювати інші послідовності, присутні в їх оточенні. Опускання навколишньої температури дозволяє однонитевым молекулам розважатись або «гибридизоваться» один з одним. Це і є метод гібридизації ДНК.
Поняття з точки зору молекулярної біології
Вчені, які займаються як реплікацією ДНК, так і транскрипцією ДНК в РНК, покладаються на схрещування нуклеотидів між собою і методи молекулярної біології. Сюди включаються Саузерн-блоты та Нозерн-блоты, полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) і більшість підходів до секвенированию і гібридизації ДНК-РНК.
Застосування
Гібридизація є основним властивістю нуклеотидних послідовностей і використовується в численних методи молекулярної біології. Загальна генетичний взаємозв’язок двох видів може бути визначена шляхом гібридизації сегментів ДНК (ДНК-ДНК-гібридизація). Із-за схожості послідовностей між близькородинними організмами потрібна більш висока температура для танення таких гібридів ДНК порівняно з більш віддаленими організмами. Різні методи використовують гібридизацію для визначення походження зразка ДНК, включаючи полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР). В іншому методі короткі послідовності ДНК гибридизуются з клітинної мРНК для ідентифікації експресованих генів. Фармацевтичні компанії вивчають використання антисмислової РНК для зв’язування з небажаною мРНК, запобігаючи рибосому від переведення мРНК в білок.
ДНК-ДНК-гібридизація зазвичай відноситься до методу молекулярної біології, який вимірює ступінь генетичного подібності між пулами послідовностей ДНК. Він зазвичай використовується для визначення генетичного відстані між двома організмами. Це широко використовувалося у філогенії та таксономії.
Методологія
ДНК одного організму мітили, потім змішували з не меченной ДНК, яку можна було порівняти з нею. Суміш інкубують, щоб дозволити ланцюгах ДНК дисоціювати і потім охолоджуватися з утворенням оновленої гібридної дволанцюжкової ДНК. Гибридизированные послідовності з високим ступенем подібності будуть більш жорстко зв’язуватися і вимагають більше енергії для їх поділу: тобто вони розділяються при нагріванні при більш високій температурі, ніж різнорідні послідовності, процес, відомий як «плавлення ДНК».
Плавлення ДНК
Оцінюючи профіль плавлення гибридизованной ДНК, двухцепочечную ДНК пов’язують з так званою “колонкою”, а отриману суміш нагрівають. На кожному етапі колонку промивають, а послідовності ДНК, які плавляться, стають одноцепочечными і змивають колону. Температури, при яких помічена ДНК виходить з колонки, відображає кількість подібності між послідовностями (і зразок самосгибания служить в якості контролю). Ці результати об’єднані, щоб визначити ступінь генетичної подібності між організмами. Як стверджує сучасна мікробіологія, гібридизація ДНК неможливо без розуміння цих речей.
Коли кілька видів рибонуклеїнової (або дизоксирибонуклеиновой) кислоти порівнюються таким чином, значення подібності дозволяють розміщувати види в філогенетичному дереві. Отже, це один з можливих підходів до проведення молекулярної систематики. Чарльз Сіблі і Джон Альквист, піонери цієї техніки, використовували ДНК-ДНК-гібридизацію для вивчення філогенетичних відносин птахів (систематика Сіблі-Алквиста) і приматів.
Значення для біології
ДНК-ДНК-гібридизація є золотим стандартом для розрізнення бактеріальних видів з величиною схожості понад 70%, що вказує на те, що порівнювані штами належать до різних видів. У 2014 році був запропонований поріг 79% подібності для поділу бактеріального підвиди.
Критики стверджують, що техніка неточна для порівняння близьких видів, так як будь-яка спроба виміряти відмінності між ортологическими послідовностями між організмами перевантажена гібридизацією паралоговых аналогів в геномі організму. Секвенування ДНК і обчислювальні порівняння послідовностей в даний час зазвичай є методом визначення генетичного відстані, хоча цей підхід все ще використовується в мікробіології, щоб допомогти ідентифікувати бактерії.
Сучасний спосіб полягає у проведенні гібридизації ДНК-ДНК в силіконі з використанням повністю або частково секвенированных геномів. GGDC, розроблений в DSMZ, є найбільш точним відомим інструментом для обчислення DDH-аналогічних значень. Серед інших алгоритмічних поліпшень він вирішує проблему з паралогическими послідовностями, ретельно фільтруючи їх з збігів між двома послідовностями геному.
Метод FISH
Флуоресцентна гібридизація молекул ДНК (Fluorescence In Situ Hybridization – FISH) являє собою лабораторний метод, що використовується для виявлення і визначення послідовності ДНК, часто на певній хромосомі.
У 1969 році Джозеф Галл і Мері Лу Парду опублікували документ, який демонструє, що радіоактивні копії послідовності рибосомной ДНК можуть бути використані для виявлення комплементарних послідовностей ДНК в ядрі лягушечьего яйця. Починаючи з цих оригінальних спостережень, багато уточнення підвищили універсальність і чутливість процедури до такої міри, що гібридизація in situ (“на своєму місці”, латинь) в даний час вважається важливим інструментом в цитогенетике. (Терміном in situ в даний час також позначають початкову стадію росту карциноми, коли в патологічний процес втягнута лише епітеліальна тканина.)
Послідовність флуоресцентної гібридизації
РНК-зонди можуть бути сконструйовані для будь-якого гена або будь-якій послідовності всередині гена для візуалізації мРНК lncRNA і miRNA в тканинах і клітинах. FISH використовується шляхом вивчення клітинного циклу розмноження, зокрема інтерфази ядер для будь-яких хромосомних аномалій. FISH дозволяє аналізувати велику серію архівних випадків, набагато легше ідентифікувати виявлену хромосому, створюючи зонд з штучним хромосомним підставою, який буде залучати подібні хромосоми.
Сигнали гібридизації для кожного зонда, коли виявляється аномалія ядра: кожен зонд для виявлення мРНК і lncRNA складається з 20 пар олігонуклеотидів, кожна пара покриває простір 40-50 б. п. Для виявлення мРНК зонди використовують запатентовану хімію.
Гібридизація з ДНК-зондами
Зонди часто отримують з фрагментів ДНК, які були виділені, очищені і амплифицированы для використання в проектуванні геному людини. Розмір людського геному настільки великий у порівнянні з довжиною, яка може бути секвенирована напряму, що необхідно розділити його на фрагменти. В кінцевому рахунку ці фрагменти наводилися шляхом перетравлення копії кожного фрагмента в ще більш дрібні елементи з використанням ендонуклеаза, специфічних для послідовностей, для вимірювання розміру кожного невеликого фрагмента з використанням ексклюзивної хроматографії з використанням цієї інформації для визначення, де великі частини перекривалися один з одним.
Щоб зберегти елементи з їх індивідуальними послідовностями ДНК, фрагменти були додані в систему постійно повторюваних популяцій бактерій. Клональні популяції бактерій, кожна популяція, яка підтримує єдину штучну хромосому, зберігаються в різних лабораторіях по всьому світу. Штучні хромосоми (BAC) можна вирощувати, витягувати і додавати в будь-якій лабораторії, містить бібліотеку. Геномні бібліотеки часто називаються на честь установ, в яких вони були розроблені. Прикладом може служити бібліотека RPCI-11, названа в честь Інституту раку Розвела в Баффало (Нью-Йорк, США). Ці фрагменти складають близько 100 тисяч базових пар і є основою більшості зондів FISH.
