Усі біохімічні реакції, що протікають в організмі, схильні специфічного контролю, який здійснюється через активуючий або інгібуючий вплив на регуляторні ферменти. Останні зазвичай знаходяться в початку ланцюжків метаболічних перетворень і запускають багатоетапний процес, або гальмують його. Регулювання також піддаються деякі поодинокі реакції. Конкурентне інгібування є одним з основних механізмів контролю каталітичної активності ферментів.
Що таке інгібування?
Механізм ферментативного каталізу заснований на зв’язуванні активного центру ензиму з молекулою субстрату (комплекс ES), в результаті чого відбувається хімічна реакція з утворенням і звільненням продукту (E+S = ES = EP = E+P).
Інгібуванням ферменту називають зниження швидкості або повну зупинку процесу каталізу. У більш вузькому значенні під цим терміном розуміють зменшення спорідненості до активного центру до субстрату, що досягається шляхом зв’язування молекул ензимів з речовинами-інгібіторами. Останні можуть діяти різними способами, на підставі чого поділені на кілька типів, яким відповідають однойменні механізми інгібування.
Основні типи інгібування
За характером протікання процесу інгібування буває двох видів:
- Необоротне – викликає стійкі зміни в молекулі ферменту, позбавляють її функціональної активності (остання не підлягає відновленню). Воно може мати як специфічний, так і неспецифічний характер. Інгібітор міцно зв’язується з ензимом шляхом ковалентного зв’язків.
- Оборотне – основний вид негативної регуляції ферментів. Здійснюється за рахунок оборотного специфічного приєднання інгібітора до білка-энзиму слабкими нековалентными зв’язками, піддається кінетичного опису по рівнянню Міхаеліса-Ментен (виняток становить аллостерическая регуляція).
Виділяють два основних типи оборотного інгібування ферментів: конкурентне (може бути ослаблено збільшенням концентрації субстрата) та неконкурентні. В останньому випадку відбувається зниження максимально можливої швидкості каталізу.
Основна різниця між конкурентними та неконкурентними інгібуванням полягає в місці приєднання регуляторного речовини до ферменту. У першому випадку інгібітор пов’язується безпосередньо з активним центром, а в другому – з іншою ділянкою ензиму, або з фермент-субстратным комплексом.
Існує також змішаний тип інгібування, при якому зв’язування з інгібітором не запобігає утворенню ES, але уповільнює каталіз. У цьому випадку речовина-регулятор знаходиться в складі подвійних або потрійних комплексів (EI і EIS). При безконкурентному типі фермент пов’язується тільки з ES.
Особливості оборотного конкурентного інгібування ферментів
Конкурентний механізм інгібування заснований на структурному схожості регуляторного речовини з субстратом. В результаті утворюється комплекс активного центру з інгібітором, умовно позначається як EI.
Оборотне конкурентне інгібування має наступні особливості:
- зв’язування з інгібітором відбувається в активному центрі;
- інактивація молекули ферменту оборотна;
- інгібуючий ефект може бути зменшений збільшенням концентрації субстрату;
- інгібітор не впливає на максимальну швидкість ферментативного каталізу;
- комплекс EI може розпадатися, що характеризується відповідною константою дисоціації.
При такому типі регуляції інгібітор і субстрат як би змагаються (конкурують один з одним за місце в активному центрі, звідки і походить назва процесу.
У підсумку конкурентне інгібування можна визначити як оборотний процес гальмування ферментативного каталізу, заснований на специфічному спорідненості активного центру до речовини-ингибитору.
Механізм дії
Зв’язування інгібітора з активним центром перешкоджає утворення фермент-субстратного комплексу, необхідного для здійснення каталізу. В результаті молекула ензиму стає неактивною. Тим не менш каталітичний центр може зв’язатися не тільки з інгібітором, але і з субстратом. Ймовірність утворення того або іншого комплексу залежить від співвідношення концентрацій. Якщо молекул субстрату значно більше, то фермент буде реагувати з ними частіше, ніж з інгібітором.
Вплив на швидкість хімічної реакції
Ступінь гальмування каталізу при конкурентному інгібуванні визначається тим, яка кількість ферменту будуть утворювати EI-комплекси. При цьому можна збільшити концентрацію субстрату до такої міри, що роль інгібітора буде витіснена, а швидкість каталізу досягне максимально можливого значення, відповідного величині Vmax по рівнянню Міхаеліса-Ментен.
Таке явище пояснюється сильним розбавленням інгібітора. Як наслідок, імовірність зв’язування з ним молекул ферменту зводиться до нуля, а активні центри реагують тільки з субстратом.
Кінетичні залежності ферментативної реакції за участю конкурентного інгібітору
Конкурентне інгібування збільшує константу Міхаеліса (Km), яка дорівнює концентрації субстрату, необхідної для досягнення ½ максимальної швидкості каталізу на початку реакції. Кількість ферменту, гіпотетично здатну зв’язатися з субстратом, залишається постійним, а число фактично утворюються ES-комплексів залежить тільки від концентрації останнього (комплекси EI не постійні і можуть бути витіснені субстратом).
Конкурентне інгібування ферментів легко визначити за графіками кінетичної залежності, побудованим для різних концентрацій субстрату. В цьому випадку величина Km буде змінюватися, а Vmax залишатися постійною величиною.
При неконкурентному інгібуванні все навпаки: інгібітор зв’язується поза активного центру і присутність субстрату ніяк не може на це вплинути. В результаті частина молекул ферменту “вимикається” з каталізу, та максимально можлива швидкість знижується. Тим не менш активні молекули ензиму можуть безперешкодно зв’язуватися з субстратом як при маленькій, так і при високій концентрації останнього. Отже, константа Міхаеліса залишається постійною.
Графіки конкурентного інгібування в системі подвійних зворотних координат являють собою кілька прямих, що перетинають вісь ординат у точці 1/Vmax. Кожна пряма відповідає певній концентрації субстрату. Різні точки перетину з віссю абсцис (1/[S]) говорять про зміну константи Міхаеліса.
Дія конкурентного інгібітору на прикладі малоната
Типовим прикладом конкурентного інгібування є процес зниження активності сукцинатдегидрогиназы — ферменту, що каталізує окислення бурштинової кислоти (сукцинату) в фумаровую. В ролі інгібітора тут виступає малонат, що має структурну схожість з сукцинатом.
Додавання інгібітору в середу викликає утворення комплексів малоната з сукцинатдегидрогиназой. Такий зв’язок не викликає пошкодження активного центру, але блокує його доступність для бурштинової кислоти. Збільшення концентрації сукцинату знижує інгібуючий ефект.
Використання в медицині
На механізмі конкурентного інгібування заснована дія багатьох лікарських препаратів, що представляють собою структурні аналоги субстратів деяких метаболічних шляхів, гальмування яких є необхідною частиною лікування захворювань.
Наприклад, для поліпшення провідності нервових імпульсів при м’язових дистрофіях потрібно підвищити рівень ацетилхоліну. Це досягається пригніченням активності гідролизуючої його ацетилхолінестерази. У ролі інгібіторів виступають четвертинні амонієві основи, що входять до складу лікарських препаратів (прорезин, эндрофоний тощо).
В особливу групу виділяють антиметаболіти, які крім інгібуючої дії проявляють властивості псевдосубстрата. У такому разі формування комплексу EI призводить до утворення біологічно інертного аномального продукту. До антиметаболитам відносять сульфаніламіди (використовуються при лікуванні бактеріальних інфекцій), аналоги нуклеотидів (застосовуються для зупинки клітинного росту ракової пухлини) і т. д.
