Фарбування за Грамом: методика та теоретичне пояснення

Фарбування за Грамом широко поширене в мікробіології, так як це один з найпростіших способів диференціації бактерій в залежності від їх складу клітинної стінки. За Грамом всі бактерії можна розділити на грампозитивні (Грам(+)) і грамнегативні (Грам(-)). Метод фарбування за Грамом був розроблений у 1884 році, і з того часу не втратив популярності, хоча і неодноразово модифікувався.

Структура клітинної стінки

Фарбування за Грамом дозволяє виявити, до грампозитивних або грамнегативних відноситься та чи інша бактерія. Поділ бактерій на Грам(+) і Грам(-) здійснюється у відповідності з будовою їх клітинної стінки.

Клітинна стінка в найбільшій кількості містять пептидоглікан (муреин) — складна речовина, до складу якого входять пептапептид і глікан. Глікан складається з чергуються залишків N-ацетилглюкозаміну та N-ацетілмурамовою кислоти, з’єднаних один з одним β-1,4-глікозидними зв’язками. Пептидоглікан забезпечує підтримання форми клітини, осмотичну захист, а також антигенні функції.

Основні відмінності грампозитивних і грамнегативних бактерій

У різних бактерій товщина шару пептидоглікану не однакова. У бактерій, які відносять до грампозитивних, вона становить від 15 до 80 нм, в той час як у грамнегативних — від 2 до 8 нм. У той же час у грамнегативних бактерій під шаром пептидоглікану є особлива структура, якої немає у грампозитивних бактерій — периплазматическое простір. Це простір заповнений гидролитическими ферментами — β-лактамазой, рибонуклеазой 1, фосфатазой. Саме ці ферменти відповідальні за резистентність грамнегативних бактерій відносно багатьох антибіотиків.

Шар пептидоглікану Грам(-) бактерій пов’язаний з липополисахаридом — антигенною структурою, містить ендотоксин. У Грам(+) бактерій схожі функції виконують тейхоевые кислоти.

У грамнегативних бактерій є додаткова структура — зовнішня мембрана.

Суть методу фарбування

Перед тим як розпочати фарбування, готують мазки досліджуваних бактерій. Для цього на предметне скло капають воду і бактеріальної петлею додають туди культуру мікроорганізмів. Потім, після повного висихання води, мазок фіксують — предметне скло проносять кілька разів над полум’ям пальника. Фарбування мазків за Грамом більш ефективно, ніж фарбування живих бактерій — з мертвими клітинами краще зв’язуються молекули барвника.

Дивіться також:  Гігроскопічність - що це? Гігроскопічність матеріалів

Фарбування проводиться в кілька етапів:

  1. На фіксований мазок накладають невеликі шматочки фільтрувального паперу і наливають основний барвник — генціанвіолет або метиленовий синій.
  2. Через 3-5 хвилин знімають пофарбовану фільтрувальний папір і заливають мазок розчином Люголя на 1 хвилину. При цьому препарат темніє.
  3. Зливають розчин Люголя і обробляють мазок чистим етиловим спиртом: капають кілька крапель на препарат, через 20 секунд зливають. Процедуру повторюють 2-3 рази.
  4. Промивають скло з досліджуваним препаратом дистильованою водою.
  5. Проводять додаткове фарбування — дофарбовували препарат фуксином. Через 1-2 хвилини барвник змивають.
  6. Після висихання води вивчають під мікроскопом мазок. Грампозитивні бактерії будуть мати синьо-фіолетовий колір, грамнегативні — рожевий або червоний.

Причини різного характеру фарбування

Як було описано вище, при фарбуванні бактерій за Грамом грампозитивні бактерії забарвлюються у синьо-фіолетовий колір, а грамнегативні — в червоний або рожевий. Причина диференціального фарбування бактерій за цим методом полягає в тому, що після потрапляння в клітку розчинної форми генціанвіолета барвник переходить у нерозчинну йодну форму. Під час обробки бактерії етиловим спиртом під дією цього неполярного розчинника з мембрани екстрагуються ліпіди. Після цього мембрана стає пористою і більше не є суттєвою перешкодою для вимивання барвника. Однак пептидоглікан більш стійкий до дії неполярних розчинників, в тому числі і спирту. Саме він перешкоджає вимиванню барвника, тому бактерії з товстим муреиновым шаром забарвлюється в синьо-фіолетовий колір (грамположительно), і після обробки спиртом свій колір не змінюють.

Тонкий муреиновый шар грамнегативних бактерій не може втримати в клітці молекули барвника, тому після дії спирту вони стають безбарвними — забарвлюються грамотрицательно.

Після впливу на мазок фуксином при фарбуванні за Грамом грампозитивні бактерії залишаються синьо-фіолетовими, а грамнегативні набувають рожево-червоний відтінок.

Дивіться також:  Габитология - це криміналістичне вчення про зовнішньому вигляді людини. Судова габитология

Приклади Грам(+) і Грам(-) бактерій

До грамнегативних відносяться ціанобактерії, сіробактерії, залізобактерії, хламідії, рикетсії, оцтові бактерії, багато метилобактерии, тионовые бактерії, арсенитобактерии, карбоксидобактерии.

Грампозитивними є біфідобактерії, багато водні бактерії, стрептококи і стафілококи.